Cre Recombinase, TAT-Cre (Tat-NLS-Cre, HTNC, HTNCre)

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Cre重組酶通?？s寫(xiě)為Cre，是一種I型酶拓?fù)洚悩?gòu)酶來(lái)自P1噬菌體催化loxP位點(diǎn)間DNA的位點(diǎn)特異性重組。這種酶不需要任何能量輔因子Cre介導(dǎo)的重組底物和反應(yīng)產(chǎn)物之間迅速達(dá)到平衡。loxP識(shí)別元件是一個(gè)34堿基對(duì)(bp)序列，由兩個(gè)13 bp反向重復(fù)序列組成，側(cè)翼是一個(gè)8 bp間隔區(qū)，提供方向性。重組產(chǎn)物依賴(lài)于loxP位點(diǎn)的位置和相對(duì)方向。含有單個(gè)loxP序列的兩種DNA將會(huì)融合，而相同方向的loxP序列之間的DNA將以環(huán)狀形式被切除，相對(duì)的loxP序列之間的DNA相對(duì)于其余的DNA是反向的。

Cre重組酶被用作修飾基因和染色體的工具。在這種方法中，Cre重組酶用于在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中刪除LoxP位點(diǎn)側(cè)翼的DNA片段(也稱(chēng)為“floxed")。在許多轉(zhuǎn)基因物種中，它已被用于產(chǎn)生具有僅限于某些細(xì)胞類(lèi)型的突變(組織特異性敲除)的動(dòng)物或具有可通過(guò)給藥激活的突變(誘導(dǎo)性敲除)的動(dòng)物。具有組織特異性或可誘導(dǎo)的Cre表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系的可獲得性允許研究人員簡(jiǎn)單地通過(guò)將固定的動(dòng)物繁殖到預(yù)先存在的Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)滅活或激活感興趣的基因。誘導(dǎo)型Cre重組酶系統(tǒng)的一個(gè)例子是Cre-ER (ER =雌激素受體蛋白)系統(tǒng)，其中腹腔內(nèi)注射關(guān)于三苯氧胺會(huì)引起取決于劑量的切除固定位點(diǎn)(即使選擇的基因失活)。

重組Cre重組酶(TAT-Cre)從攜帶工程質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中純化，所述工程質(zhì)粒編碼來(lái)自噬菌體P1的增強(qiáng)形式的Cre重組酶。這種Cre重組酶具有一個(gè)N-末端6XHis標(biāo)簽、一個(gè)Tat肽(GRKKRRQRRRPPAGTSVSL)和一個(gè)NLS序列(PKKKRKV)。與其它形式的Cre重組酶(例如HNC、TCH6、HC、HNCM、CH)相比，HTNC是轉(zhuǎn)導(dǎo)(體內(nèi))和隨后重組中*有效的蛋白質(zhì)。成纖維細(xì)胞報(bào)告細(xì)胞與1微米HTNC孵育1至2小時(shí)，可導(dǎo)致60 ~ 90%的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。向培養(yǎng)基中添加100微米氯喹可以進(jìn)一步增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)和重組。

應(yīng)用程序

• 用于亞克隆或載體/克隆工程的體外LoxP重組

• 體外轉(zhuǎn)導(dǎo)到包括干細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞中

性能：

濃度:2、5或10毫克/毫升。

分子量:43千道爾頓

QC: Tat-Cre在HEK293T- Cre報(bào)告細(xì)胞中誘導(dǎo)80~100%的重組效率。用報(bào)道質(zhì)粒DNA: LoxP-RFP-Stop-LoxP-GFP轉(zhuǎn)染HEK 293t-細(xì)胞，然后加入1個(gè)微米純化的Tat-Cre蛋白。

圖1: 0:添加Tat-Cre前；用Tat-Cre轉(zhuǎn)導(dǎo)后1至5天。

內(nèi)毒素水平:< 0.1歐盟單位/微克

通過(guò)SDS-PAGE和HPLC分析，純度> 98%。

單位定義：100單位的標(biāo)準(zhǔn)被定義為在HEK 293T報(bào)道細(xì)胞系分析中誘導(dǎo)50% GFP表達(dá)所需的1.0 mL組織培養(yǎng)基中TAT-CRE的量(μg)。

穩(wěn)定性：零下80度2年oC.零下20度6個(gè)月oC.最長(zhǎng)3周，4oC

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