吡咯啉5羧酸合成酶（P5CS）測試盒

 微量法 100管/48樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：                           

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同，分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS， Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是以谷氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶，對植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

測定原理：

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成P5C過程中分解ATP生成ADP和無機磷，通過鉬酸銨比色法測定單位時間內(nèi)產(chǎn)生無機磷的量可確定P5CS活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體60 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體12 mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體12 mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存，用時加入25 mL蒸餾水，溶解后4℃保存一周；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存，用時加入25 mL蒸餾水，溶解后4℃保存一周；

試劑六：液體25mL×1瓶，室溫保存；

試劑七：10mmol/L標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液10mL×1瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑七 20倍稀釋，即取 0.1mL試劑七加1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

樣品酶液的制備：

1、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm。

2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴10min

混勻，8000g，25℃離心10min，取上清液

3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。

注意：

1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒100管保證測 48份P5CS活性。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。每個測定管設(shè)一個對照管。

計算

1、血清（漿）P5CS活力的計算:

單位定義：每小時每毫升血清（漿）中P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

P5CS活力（μmol/h/mL）=C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷V樣÷T=9 ×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

2、組織中P5CS活力的計算：

（1）按蛋白濃度計算：

單位定義：每小時每毫克組織蛋白中P5CS消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

P5CS活力(μmol/h /mg prot)=C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷（Cpr×V樣）÷T =9 ×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每小時每克組織中P5CS消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。P5CS活力(μmol/h /g 鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=9 ×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.3mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1/6小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

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