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免疫熒光的高通量細(xì)胞蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)是一種定量免疫熒光測(cè)定，在多孔板（優(yōu)化為96孔或384孔格式）中進(jìn)行，結(jié)合了Western blotting的特異性與ELISA的可重復(fù)性和通量。
該測(cè)定也稱為細(xì)胞印跡、細(xì)胞基ELISA、細(xì)胞內(nèi)ELISA（ICE）和FACE（快速活化細(xì)胞基ELISA）。通過(guò)In-Cell Western，可以：
利用靶特異性一級(jí)抗體和IRDye二級(jí)抗體檢測(cè)固定和滲透細(xì)胞中的蛋白質(zhì)®
使用光譜上不同的熒光染料共軛物定量多個(gè)靶點(diǎn)
快速且準(zhǔn)確地測(cè)量多個(gè)樣本中的相對(duì)蛋白質(zhì)水平
在相關(guān)細(xì)胞環(huán)境中檢測(cè)蛋白質(zhì)
歸一化為細(xì)胞數(shù)，便于準(zhǔn)確定量和比較各孔間蛋白質(zhì)表達(dá)
Empiria Studio 軟件為多種多孔板式測(cè)定提供分步工作流程和板式模板，包括In-Cell Western Assay。Empiria Studio 中這些簡(jiǎn)單且系統(tǒng)的工作流程自動(dòng)化了分析的關(guān)鍵步驟。對(duì)于In-Cell Western Assays，可以創(chuàng)建自定義模板或使用以下六個(gè)預(yù)設(shè)模板之一：®
細(xì)胞染色線性性：確保歸一化方法和靶材的信號(hào)強(qiáng)度均在其線性范圍內(nèi)被檢測(cè)到
抗體滴定：確定提供最佳信號(hào)和*低背景的抗體濃度
阻斷劑評(píng)估：確定實(shí)驗(yàn)中最佳阻斷緩沖液或阻斷緩沖劑與抗體組合
固定與滲透評(píng)估：確定實(shí)驗(yàn)的最佳固定和滲透條件
Z′因子測(cè)定：測(cè)試測(cè)定的質(zhì)量和穩(wěn)健性
靶點(diǎn)分析：量化治療或病癥對(duì)靶點(diǎn)的影響
蛋白質(zhì)磷酸化
（藥物化合物對(duì)信號(hào)通路的影響;信號(hào)傳導(dǎo)的時(shí)序/動(dòng)力學(xué); IC50determination)
GPCR激活
Tau蛋白的積累與抑制
基因表達(dá)水平
病毒滴度/載量
凋亡：Caspase-3激活
細(xì)胞表面蛋白與受體內(nèi)化
RNAi療效
細(xì)胞增殖檢測(cè)
本測(cè)定基于標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光方法。
多孔板中的種子細(xì)胞
細(xì)胞處理（可選）
固定單元
細(xì)胞滲透化
阻斷單元
制備初級(jí)抗體溶液
培養(yǎng)一級(jí)抗體溶液
洗盤
準(zhǔn)備二級(jí)抗體溶液和細(xì)胞染色劑，如CellTag™ 520染色劑或CellTag 700染色劑
培養(yǎng)二級(jí)抗體溶液和細(xì)胞染色
洗盤
圖像多孔板
本測(cè)定比Western Blotting具有更高的復(fù)現(xiàn)性和精度。細(xì)胞內(nèi)西方測(cè)定顯示以下特征：
更短的協(xié)議
顯著更小的標(biāo)準(zhǔn)差
復(fù)現(xiàn)變異系數(shù)極低的測(cè)量值（CV）（見(jiàn)圖1）
可以輕松運(yùn)行多次復(fù)制以提高準(zhǔn)確性（見(jiàn)圖2）
表征廣泛的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)參數(shù)
與西部片相比，信號(hào)的增減特征非常相似
在優(yōu)化條件下和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下，能夠產(chǎn)生優(yōu)異的Z′因子
Z′因子是統(tǒng)計(jì)效應(yīng)大小的衡量指標(biāo)，可用于評(píng)估檢測(cè)反應(yīng)是否需要進(jìn)一步調(diào)查。Z′因子可以為檢測(cè)的可重復(fù)性提供一定的指示。Z′ 是通過(guò)運(yùn)行大量正對(duì)照和陰對(duì)照，并確定正負(fù)對(duì)照之間的間隔來(lái)計(jì)算的。如果由于對(duì)照組內(nèi)部差異很大，它們重疊或幾乎重疊（Z′ < 0.5），該檢測(cè)法對(duì)篩選無(wú)效。優(yōu)異的檢測(cè)方法顯示陽(yáng)性與陰性對(duì)照的良好分離（Z′ > 0.5）。 2,4,5
2010年一項(xiàng)研究比較了本測(cè)定法和WB 測(cè)量磷酸化肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈（PMLC20）。1使用催產(chǎn)素刺激的子宮肌細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)物，評(píng)估兩種磷酸分析方法的特異性、敏感性和精度。
本測(cè)定法和WB分析結(jié)果非常相似（見(jiàn)圖1）。本測(cè)定提供了更好的精度、更低的變異性和更小的CV。
Figure 2. Replicability of In-Cell Western Assay for siRNA screening via a correlation plot. A pilot small molecule siRNA screen was performed for inhibitors of mTORC1 signaling. A library of ~2500 known bioactive compounds was used. Compounds with average Z-score < -2 are considered hits (red circles). Known inhibitors of mTORC1 signaling found in the library are shown in green. Plate-to-plate consistency is shown for a representative plate from the library. R2 = 0.91, indicating exceptional plate-to-plate reproducibility. Adapted with permission from Hoffman, GR et al.2本測(cè)定法和WB結(jié)果及其他檢測(cè)結(jié)果高度相關(guān)。
信號(hào)的增減曲線非常相似，IC也相似50數(shù)值與敏感度
改進(jìn)的復(fù)制性和精度1
顯著更小的標(biāo)準(zhǔn)差
用非常低的CV復(fù)現(xiàn)測(cè)量結(jié)果
更高的通量，便于并行處理大量樣品或復(fù)制品
In Figure 3 and Figure 4, TPA dose response was assessed by In-Cell Western Assay and Western blot. In-Cell Western EC50 values were calculated (Figure 3) that closely match the EC50 values calculated in a Western blot analog (Figure 4).8
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