核酸定量依賴(lài)于測(cè)量DNA和RNA的紫外吸收率，常見(jiàn)于260納米，核堿基在該處吸收力強(qiáng)。通過(guò)結(jié)合比爾-朗伯定律與消光系數(shù)，吸收值可以直接與核酸濃度相關(guān)。230 nm和260 nm的吸收為評(píng)估樣品純度提供了便捷的基礎(chǔ)，支持基因組DNA、PCR產(chǎn)物及其他制備核酸樣品的質(zhì)量控制。與熒光染料測(cè)定結(jié)合使用，吸收度測(cè)量為定義DNA或RNA濃度提供了實(shí)用框架，以便后續(xù)應(yīng)用。

比爾定律是描述物質(zhì)濃度與其在已知光程距離下光吸收之間的關(guān)系的方程。

其中：

• Abs = 吸收度

• l = 光路長(zhǎng)度：光線(xiàn)穿過(guò)物質(zhì)的距離

• ε = 摩爾消光系數(shù)：衡量物質(zhì)在特定波長(zhǎng)下吸收光線(xiàn)的強(qiáng)度

• C = 物質(zhì)濃度

我們可以用核酸濃度因子替代消光系數(shù)，因?yàn)檫@是另一種可用來(lái)關(guān)聯(lián)物質(zhì)吸收光線(xiàn)能力與濃度的數(shù)值。隨后可用于核酸定量。

什么是核酸濃度因子，它們是如何確定的？

核酸濃度因子是波長(zhǎng)特異性的轉(zhuǎn)換因子，將吸收率與不同核酸類(lèi)型的濃度聯(lián)系起來(lái)，從而能夠通過(guò)紫外吸收率測(cè)量直接計(jì)算DNA或RNA濃度。

這些核酸濃度因子是通過(guò)測(cè)量特定核酸在特定路徑長(zhǎng)度下吸收為1所需的濃度來(lái)確定的。已確定，在1厘米路徑長(zhǎng)度下，吸收率為1（1 Abs）需要0.02 ng/μL的dsDNA濃度。

該濃度隨后可利用下方重組的比爾定律方程求得因子（F）值。該因子隨后將替換消光系數(shù)：

該因子可用于下方重新排列的比爾定律方程，求解吸收度測(cè)量的未知濃度，如DS-11系列分光光度計(jì)所示：

同樣的計(jì)算方法也用于確定其他核酸的濃度因子。DS-11還用到的其他因素如下：

ssDNA：33 ng/uL
ssRNA：40 ng/uL

這些濃度因子與其消光系數(shù)成反比。在260納米處，1A所需的核酸量越高，相應(yīng)的濃度因子越低。

為什么核酸濃度因子不同？

dsDNA、ssDNA和RNA具有不同的化學(xué)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)，導(dǎo)致光吸收行為各異。這意味著每種核酸的濃度不同，才能在260納米波長(zhǎng)下達(dá)到1.0的吸收率。核酸的以下特性導(dǎo)致了消光系數(shù)和濃度因子的不同：

• dsDNA：其雙螺旋結(jié)構(gòu)，鍵彼此接近，氫鍵將結(jié)構(gòu)連接在一起，導(dǎo)致紫外線(xiàn)吸收率降低。

• ssDNA：其堿基暴露得更明顯，不像DSD那樣受到堿基堆疊的相互作用影響。

• RNA：核糖和額外的羥基會(huì)干擾紫外線(xiàn)吸收。

學(xué)習(xí)如何用DeNovix計(jì)算核酸濃度

核酸濃度因子為利用吸收度計(jì)算核酸濃度提供了一種簡(jiǎn)化的方法。這些變化的數(shù)值恰當(dāng)?shù)乜紤]了核酸結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的光吸收模式差異。您可以通過(guò)這里的微體積核酸性能數(shù)據(jù)，了解DS-11系列分光光度計(jì)/熒光儀在寬廣范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)的高精度和線(xiàn)性度?；蛘呗?lián)系咨詢(xún)！