使用 RNAstorm™ 試劑盒獲得的 RNA 中是否存在任何污染的基因組 DNA？

基因組 DNA 的污染是一個大問題，因為它會干擾下游應用。 RNAstorm™ 試劑盒包括優(yōu)化的 DNase 消化步驟，可去除污染的基因組 DNA，而不顯著影響 RNA 產量。雖然此步驟是可選的，但強烈建議這樣做。

我期望從 FFPE 樣品中獲得多少 RNA？

影響獲得的RNA總量的最大變量是樣品本身的質量（即組織的類型和數量，以及樣品分離和保存的注意事項）。使用 RNAstorm™ 試劑盒，并假設至少合理的樣品質量，可以獲得大于 1 µg 的量。

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA可以用于RNA-Seq嗎？

是的。只要 RNA 的質量足夠高，就可以獲得高質量的文庫。對于 Illumina 測序，建議 DV200 至少為 30%，并且應使用提供至少 1 µg RNA 的樣品。

組織應該如何準備？

使用切片機從 FFPE 樣品中獲取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用小于 5 µm 的切片。不建議使用厚度超過 10 µm 的切片，因為它們可能無法全消化。此外，每次提取應使用不超過 5 個切片（每個 10 µM）。使用過多的組織會導致消化不全并降低產量。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎？

是的，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下，我們建議機械研磨相當于推薦切片數量的組織。

我可以使用 FFPE 芯嗎？

是的，可以使用 FFPE 芯材。由于核心不使用切片機進行處理，因此樣品消化往往更加困難，如果觀察到消化不全，建議使用機械均質化（例如使用鋼珠）。

您推薦哪種脫蠟方法？

RNAstorm™ 試劑盒包含推薦的脫蠟試劑。與其他常見方法（例如二甲苯）不同，脫蠟試劑高效、無毒，并且不需要使用通風柜。在我們的測試中，所包含的試劑在去除石蠟和純化高質量核酸方面至少與二甲苯一樣有效。

定量從 FFPE 樣品中獲得的 RNA 的最佳方法是什么？

與從新鮮樣品中獲得的 RNA 相比，準確定量 FFPE 衍生的 RNA 更具挑戰(zhàn)性。僅僅知道存在的 RNA 的絕對量是不夠的，還要知道 RNA 是否會在下游應用中發(fā)揮作用，這取決于以下因素：

• 片段大小分布：如果 5 µg 樣品（通過 Qubit 測量）包含 < 200 nt 的片段，則它對于 RNA-Seq 可能毫無用處。

• 化學修飾：對于從福爾馬林固定的樣品中獲得的RNA，各種化學加合物和交聯，包括堿基修飾、堿基-堿基交聯和堿基-蛋白質交聯，可以使核酸分子無法被酶接觸，從而在下游應用中失活。

• 污染：純化過程中使用的細胞碎片、蛋白質、鹽和洗滌劑可能會導致下游檢測產生偏差。例如，Nanodrop 等基于 UV/Vis 的方法特別容易受到 200-280 nm 范圍內吸收的污染物的影響。

• 基于熒光的方法（例如 Qubit）容易出現重大錯誤。當使用低濃度的 DNA 或 RNA 時，基于染料的檢測可能不是線性的。還必須注意 RNA 樣品中基因組 DNA 的污染，因為用于熒光定量的染料并不全針對 FFPE 衍生的 DNA 或 RNA。

• 定量 PCR 是定量嚴重受損和修飾核酸的方法。

是否應該使用 RIN 編號來確定 FFPE 衍生 RNA 的質量？

盡管 RIN 數可以提供有關樣品碎片程度的一般信息，但它不夠靈敏或可預測，不足以成為下游性能的有用指標，尤其是對于 RNA-Seq。通常，FFPE 衍生 RNA 的 RIN 編號在 2 到 3 之間。其中一些樣本對 RNA-Seq 有用，而另一些則不會——但是，RIN 不會告訴您。

使用 Illumina 測序的 RNA-Seq性能預測指標稍好一些的是 DV200，它代表長度超過 200 個核苷酸的 RNA 片段的百分比。 DV200 也是基于生物分析儀數據計算的，但與所有基于生物分析儀的方法具有相同的缺點，特別是高變異性。

從 FFPE 樣品中提取 RNA 時我需要了解什么？

• 避免基于有機溶劑 (Trizol) 的方法

• 避免刺激性離液鹽（即胍鹽）

• 避免使用影響 UV 和/或 Qubit 下游定量的清潔劑（例如 Triton X-100）

• 請勿依賴 RIN 來定量 FFPE 衍生樣品的完整性。看看為什么。請改用 DV200。

• 使用去除福爾馬林化學修飾的試劑盒或方法。請勿將溫度升至 80°C 或以上。即使在此溫度下停留很短的時間也會顯著降低完整性。

• 請警惕 Qubit 和 Nanodrop 濃度，因為可能會受到有機分子或 DNA 污染。

• 使用 qPCR 定量 RNA，并始終仔細觀察熔解曲線以確定是否發(fā)生非特異性擴增。