流式細(xì)胞儀是一種對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的設(shè)備。它可以快速測(cè)量、存儲(chǔ)和顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理和生化特征參數(shù)，并可以根據(jù)預(yù)選的參數(shù)范圍篩選出的細(xì)胞亞群。大多數(shù)流式細(xì)胞儀都是零分辨率儀器，只能測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的總核酸、總蛋白等指標(biāo)，而無(wú)法識(shí)別和測(cè)量特定部位的核酸或蛋白量。也就是說(shuō)，它的細(xì)節(jié)分辨率為零。

參數(shù)測(cè)量原理

流式細(xì)胞儀可以同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，信息主要來(lái)自特異性熒光信號(hào)和非熒光散射信號(hào)。測(cè)量是在測(cè)量區(qū)域內(nèi)進(jìn)行的，所謂測(cè)量區(qū)域是照射的激光束與從孔口噴出的液流束的垂直交點(diǎn)。當(dāng)液流中心的單個(gè)細(xì)胞通過(guò)測(cè)量區(qū)域時(shí)，受到激光照射，以2π立體角向整個(gè)空間散射光。散射光的波長(zhǎng)與入射光的波長(zhǎng)相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形狀、質(zhì)膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因?yàn)檫@些生物參數(shù)還與細(xì)胞的光學(xué)特性有關(guān)，例如光的反射和折射。未染色的細(xì)胞具有散射光的特征，因此可以使用不同的散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析和分類(lèi)。當(dāng)然，由于光學(xué)特性的變化，固定和染色的細(xì)胞與活細(xì)胞具有不同的散射光信號(hào)。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)有關(guān)，還與散射角、收集散射光的立體角等非生物因素有關(guān)。

在流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量中，常用兩種散射光散射方向：①前向角（即0角）散射（FSC）； ②側(cè)向散射（SSC），又稱(chēng)90角散射。此時(shí)所說(shuō)的角度是指激光束的照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管的軸向形成的大致角度。一般來(lái)說(shuō)，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對(duì)于相同的細(xì)胞群，前向角散射光的強(qiáng)度隨著細(xì)胞橫截面積的增大而增大；對(duì)球形活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，在小立體角范圍內(nèi)基本一致。截面積的大小呈線性；對(duì)于具有復(fù)雜形狀和方向的細(xì)胞，它們可能變化很大，并應(yīng)特別注意。側(cè)向散射光的測(cè)量主要用于獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核膜的折射率更敏感，對(duì)細(xì)胞質(zhì)中較大的顆粒也能給出敏感的反應(yīng)。并且還可以對(duì)細(xì)胞質(zhì)中較大的顆粒做出靈敏的反應(yīng)。并且還可以對(duì)細(xì)胞質(zhì)中較大的顆粒做出靈敏的反應(yīng)。

實(shí)際使用時(shí)，儀器首先要測(cè)量光散射信號(hào)。當(dāng)光散射分析與熒光探針結(jié)合使用時(shí)，可以識(shí)別樣品中染色和未染色的細(xì)胞。光散射測(cè)量有效的用途是從異質(zhì)群體中識(shí)別某些亞群體。

熒光信號(hào)主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子受光照射后未經(jīng)熒光染色而發(fā)出的熒光； ②特征熒光，即熒光染料發(fā)出的熒光染料被照射后與細(xì)胞結(jié)合。熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，且波長(zhǎng)也與照射的激光不同。自發(fā)熒光信號(hào)是噪聲信號(hào)，在大多數(shù)情況下會(huì)干擾特定熒光信號(hào)的分辨率和測(cè)量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測(cè)量中，如何提高信噪比是低結(jié)合水平熒光抗體的關(guān)鍵。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞成分中自發(fā)熒光分子（如核黃素、細(xì)胞色素等）含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。

減少自發(fā)熒光的干擾，提高信噪比的主要措施有： 1、盡可能使用較亮的熒光染料； 2、選擇合適的激光器和濾光光學(xué)系統(tǒng)； 3. 使用電子補(bǔ)償電路來(lái)補(bǔ)償自發(fā)熒光的背景貢獻(xiàn)。