實時定量 PCR 是一種使用熒光化學(xué)物質(zhì)測量 DNA 擴增反應(yīng)中每個聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或外參方法對待測樣品中特定DNA序列進行定量分析的方法。

實時PCR是在PCR擴增過程中通過熒光信號實時檢測PCR過程。由于在PCR擴增的指數(shù)期內(nèi)，模板的Ct值與模板的初始拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系，因此成為定量的依據(jù)。

PCR技術(shù)原理

所謂實時定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中添加熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)品對未知模板進行定量分析的方法。曲線。

檢測方法

1. SYBR Green I 方法：

PCR反應(yīng)體系中加入過量的SYBR熒光染料。 SYBR熒光染料特異性摻入DNA雙鏈后，發(fā)出熒光信號，而未摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號，從而保證了熒光信號的增加全同步隨著PCR產(chǎn)物的增加。

2.TaqMan探針法：

當(dāng)探針完整時，報告基團發(fā)出的熒光信號被猝滅基團吸收；在 PCR 擴增過程中，Taq 酶的 5'-3' 核酸外切酶活性裂解并降解探針，形成報告熒光團和猝滅基團。將熒光基團分開，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)能夠接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就形成一個熒光分子，熒光信號的積累與DNA鏈的形成全同步。 PCR 產(chǎn)物。

技術(shù)原理

熒光素標(biāo)記的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性、低溫復(fù)性、適宜溫度延伸的熱循環(huán)，根據(jù)模板DNA互補的Taqman探針被切斷聚合酶鏈反應(yīng)定律。熒光素在反應(yīng)體系中呈游離態(tài)，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光。隨著循環(huán)次數(shù)的增加，擴增的目的基因片段呈指數(shù)增長。通過實時檢測隨擴增變化而變化的相應(yīng)熒光信號強度，獲得Ct值，同時以已知模板濃度的幾種標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，計算樣品中目的基因的拷貝數(shù)可以得到待測試的。

CT值

Ct值（Cycle Threshold，循環(huán)閾值）的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)

1. 熒光閾值（threshold）設(shè)置

PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光背景信號，熒光閾值默認（default）設(shè)置為第3-15個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，即：閾值 = 10*SDcycle 3- 15

2. Ct值與起始模板的關(guān)系

每個模板的Ct值與模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex) 初始拷貝數(shù)越高，Ct 值越低。使用已知初始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)表示初始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)表示Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
n為擴增反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為當(dāng)熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。

熒光化學(xué)品

實時定量PCR中使用的熒光物質(zhì)可分為熒光探針和熒光染料兩類。原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：在PCR擴增過程中，隨一對引物一起添加特異性熒光探針。探針是寡核苷酸，兩端都標(biāo)記有報告熒光基團和猝滅劑。熒光團。當(dāng)探針完整時，報告基團發(fā)出的熒光信號被猝滅基團吸收；在 PCR 擴增過程中，Taq 酶的 5'-3' 核酸外切酶活性裂解并降解探針，形成報告熒光團和猝滅基團。熒光基團分離，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)能夠接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈就形成一個熒光分子，熒光信號的積累與PCR的形成全同步產(chǎn)品。新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)能夠同時進行定量基因分析和基因突變（SNP）分析，有望成為基因診斷和個性化醫(yī)療分析的技術(shù)平臺。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量的SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性摻入DNA雙鏈，并發(fā)出熒光信號，而未摻入DNA雙鏈的SYBR染料分子則發(fā)出熒光信號。鏈不會發(fā)射任何熒光。信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步。 SYBR 僅與雙鏈 DNA 結(jié)合，因此熔解曲線可用于確定 PCR 反應(yīng)是否具有特異性。

3、分子信標(biāo)：是一種莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，在5、3端形成約8個堿基的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光團和猝滅基團非常接近并且不發(fā)出熒光。 PCR產(chǎn)物生成后，在退火過程中，分子信標(biāo)的中間部分與特定的DNA序列配對，熒光基因和猝滅基因分離，產(chǎn)生熒光[1]。

傳統(tǒng)定量PCR

1. 傳統(tǒng)定量PCR方法介紹

1）內(nèi)參法：將定量的內(nèi)標(biāo)和引物加入到不同的PCR反應(yīng)管中，通過基因工程方法合成內(nèi)標(biāo)。上游引物有熒光標(biāo)記，下游引物沒有熒光標(biāo)記。在擴增模板的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。 PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)和目標(biāo)模板的長度不同，可以通過電泳或高效液相分離兩者的擴增產(chǎn)物，并分別測定它們的熒光強度，內(nèi)標(biāo)可以用作定量待檢測模板的對照。
2）競爭法：選擇含有突變克隆產(chǎn)生的新內(nèi)切酶位點的外源競爭模板。在同一反應(yīng)管中，用同一對引物（其中一個引物帶有熒光標(biāo)記）同時擴增待測樣品和競爭模板。擴增后，PCR產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶消化，競爭模板的產(chǎn)物被消化成兩個片段，而待測模板則不被酶切。可以通過電泳或高效液相分離兩種產(chǎn)物，并可以單獨測量熒光強度，根據(jù)已知模板推斷未知模板的初始拷貝數(shù)。
3）PCR-ELISA法：利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，將擴增產(chǎn)物與固相板上的特異性探針結(jié)合，然后加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化反應(yīng)。底物酶結(jié)合，最后酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA方法只是定性實驗。若加入內(nèi)標(biāo)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可達到定量檢測的目的。

2. 內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用

由于傳統(tǒng)的定量方法是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而當(dāng)PCR通過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR機上重復(fù)96次，得到的結(jié)果相差很大，因此無法直接從終產(chǎn)物的量計算出起始模板的量。通過添加內(nèi)標(biāo)可以部分消除最終產(chǎn)品定量造成的誤差。但即便如此，傳統(tǒng)的定量方法也只能算是半定量和粗略的定量方法。

3.內(nèi)標(biāo)對定量PCR的影響

如果在待測樣品中加入初始拷貝數(shù)已知的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變成雙PCR，雙PCR反應(yīng)中兩個模板之間存在干擾和競爭，特別是當(dāng)內(nèi)標(biāo)的初始拷貝數(shù)為已知的內(nèi)標(biāo)時。兩個模板差異比較大的時候，這種競爭就會更加顯著。但由于待測樣品的初始拷貝數(shù)未知，因此無法添加適量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是因為這個原因，傳統(tǒng)的定量方法雖然增加了內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量方法。

實時定量PCR

實時熒光定量PCR技術(shù)有效解決了傳統(tǒng)定量僅終點檢測的局限性，實現(xiàn)每個循環(huán)檢測一次熒光信號強度，并記錄在計算機軟件中，通過計算Ct值對每個樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，無內(nèi)標(biāo)實時定量PCR基于兩個基礎(chǔ)：
1）Ct值的重現(xiàn)性 當(dāng)PCR循環(huán)達到Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增階段（對數(shù)階段）。此時，微小的誤差還沒有被放大，因此Ct值的重現(xiàn)性好。 ，即同一個模板在不同時間擴增或者在不同管中同時擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系 由于Ct值與起始模板的對數(shù)之間存在線性關(guān)系，因此可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量測定未知樣品。因此，實時熒光定量PCR是一種利用外標(biāo)曲線的定量方法。方法。
與內(nèi)標(biāo)法相比，外標(biāo)曲線定量法是一種準(zhǔn)確、可靠的科學(xué)方法。使用外標(biāo)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止最準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的定量方法。已得到世界的認可，廣泛應(yīng)用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究、藥效評估、病原檢測等領(lǐng)域。

實時熒光定量PCR的定量方法

在實時PCR中，模板定量有兩種策略：相對定量和絕對定量。

實時熒光定量PCR相關(guān)應(yīng)用

臨床疾病診斷

各類肝炎、艾滋病、流感、肺結(jié)核、性病等傳染病的診斷及療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育不良、智力低下綜合征、胎兒畸形的優(yōu)生學(xué)和產(chǎn)前檢查；腫瘤標(biāo)志物和腫瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤疾病的診斷；基因檢測實現(xiàn)了遺傳病的診斷。

動物疫病檢測

流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門氏菌、大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽桿菌。

食品安全

乳制品企業(yè)中食品源性微生物、食品過敏原、轉(zhuǎn)基因生物、坂崎腸桿菌的檢測。

科學(xué)研究

與醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、生物學(xué)相關(guān)的分子生物學(xué)定量研究。

應(yīng)用行業(yè)

各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大專院校及科研院所、疾控中心、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。由于qPCR是病原基因核酸的實時定量檢測，因此
具有更多的特性。與化學(xué)發(fā)光、時間分辨率、蛋白芯片等免疫學(xué)方法相比具有優(yōu)勢。