熒光是指光致發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種室溫物質(zhì)受到一定波長的入射光照射時，分子中的電子吸收光能后達(dá)到高能級，進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并立即去激發(fā)并恢復(fù)到原來的狀態(tài)，而多余的能量則以光的形式輻射出去，即發(fā)出比入射光波長更長的光（通常在可見光波段）。一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象立即消失。也就是說，當(dāng)物體吸收短波光的能量時，它可以發(fā)射比原來吸收的波長更長的光。具有這種性質(zhì)的物質(zhì)或分子稱為熒光素或熒光染料。

當(dāng)激光束與細(xì)胞正交時，通常會產(chǎn)生兩個熒光信號。一是細(xì)胞本身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；定量分析可以深入了解所研究的細(xì)胞參數(shù)的存在和定量。

(1) 熒光信號的意義

熒光信號可以反映不同細(xì)胞的生物學(xué)特性。例如，熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體與細(xì)胞表面的抗原、受體或膜糖蛋白特異性結(jié)合，在激光的激發(fā)下發(fā)出一定波長的熒光。熒光信號的強(qiáng)度反映了膜抗原、受體或糖蛋白的相對數(shù)量。通過收集和分析熒光信號，可以實現(xiàn)細(xì)胞亞群和功能的分析。 DNA用DNA染料染色，染料以一定的方式與DNA鏈結(jié)合。在激光的激發(fā)下，染料發(fā)出熒光，通過測量熒光的強(qiáng)度，可以獲得相對DNA含量，進(jìn)而確定細(xì)胞周期階段。分析。使用特定的熒光染料還可用于測量細(xì)胞鈣離子濃度、細(xì)胞內(nèi)pH值和細(xì)胞膜電位。

(2)熒光染料的選擇

可以使用的熒光染料有很多種，由于它們的分子結(jié)構(gòu)不同，它們的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜也不同。選擇染料或單克隆抗體標(biāo)記的熒光素時，必須考慮儀器配置的激光光源的波長，即染料的激發(fā)光譜；儀器激光器的激發(fā)光波長盡可能接近熒光染料的激發(fā)光譜峰；另外，熒光染料還必須考慮染料的發(fā)射顏色，即染料的發(fā)射光譜，需要選擇合適波段的檢測器來檢測相應(yīng)的熒光信號。

由于目前的流式細(xì)胞儀配備有多個熒光信號檢測器，當(dāng)儀器同時檢測多個熒光時，每個熒光檢測器只允許一定波長的熒光信號進(jìn)入并被檢測，因此用戶必須選擇合適的熒光信號接收器才能接收好的信號。還需要注意的是，使用激光波長相同的熒光染料，其發(fā)射波長不同，這樣才能被相應(yīng)波段的檢測器接收到，達(dá)到同時檢測的目的。

檢測器的選擇基于了解熒光染料的發(fā)射光譜。以三色FCM為例，如果熒光光譜峰落在綠色范圍內(nèi)（波長515-545nm），則選擇第一個熒光檢測器；如果光譜值落在橙紅色范圍內(nèi)(564-606nm)，則選擇第二熒光檢測器；如果熒光光譜值落在深紅色范圍內(nèi)（波長650 nm），則選擇第三個熒光檢測器。目前桌面FCM常用的激光為488nm，常用的染料有PI、PE、FITC、PERCP、CY5、APDye Fluors等。

(3) 熒光標(biāo)記抗體組合

在使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行多色分析時，如果想要得到理想的分析結(jié)果，需要選擇抗體的熒光匹配。經(jīng)?？紤]的因素如下。

1 熒光素的熒光強(qiáng)度

特定抗體區(qū)分陰性和陽性結(jié)果的能力取決于該抗體標(biāo)記的熒光素。每種熒光素具有不同的光子釋放能力和不同的相對熒光強(qiáng)度。一般用染色指數(shù)來比較不同熒光標(biāo)記的光信號強(qiáng)度。染色指數(shù)是陽性信號與陰性信號之差與陰性峰分布寬度的比值，用于判斷熒光染料區(qū)分弱陽性表達(dá)的能力。同一個單克隆抗體用8種不同的熒光素標(biāo)記，得到不同的染色結(jié)果。我們需要找到一種具有更高染色指數(shù)的熒光染料來標(biāo)記微弱的信號。

可以看出，對于特定的單克隆抗體，由于使用不同的熒光素標(biāo)記，陰性核陽性細(xì)胞的S/N比（信噪比）可相差4-6倍。一般來說，熒光信號由強(qiáng)到弱的順序為：PE>APC>PE-CY5>PERCP-CY5.5>FITC>PERCP。

選擇熒光標(biāo)記抗體時，需要考慮以下因素：

熒光素標(biāo)記效率：抗體上標(biāo)記的熒光素量（F/P）值也會影響相對熒光強(qiáng)度。每個抗體可以標(biāo)記多個 FITC 或 PERCP 分子（通常為 2-9 個），而 APC 和 PE 標(biāo)記的量約為每個抗體一個熒光分子。 FITC是小分子化合物，而PE、PERCP和APC是分子量較大的熒光蛋白。受熒光標(biāo)記化學(xué)性質(zhì)的限制，IGM型抗體通常僅標(biāo)記小分子熒光素，如FITC、TEXAS RED、CY3和CY5等。

抗體檢測的抗原密度：高表達(dá)的抗原幾乎可以用任何熒光素標(biāo)記的抗體來檢測，而低表達(dá)的抗體則需要用信噪比較高的熒光素標(biāo)記的抗體來檢測，從而有效區(qū)分陽性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞目的。

細(xì)胞自發(fā)熒光：每個細(xì)胞群的自發(fā)熒光水平各不相同，盡管可以觀察到高熒光強(qiáng)度的細(xì)胞，但在高波長范圍（>600nm）中自發(fā)熒光迅速下降。當(dāng)檢測具有高水平自發(fā)熒光的細(xì)胞時，使用具有較長發(fā)射波長的熒光染料（例如 APC）可以獲得更好的信噪比。如果是自發(fā)熒光水平較低的細(xì)胞，那么使用較長波長的激發(fā)光對于改善正負(fù)差異的現(xiàn)象影響不大?？梢允褂?FITC 標(biāo)記的抗體。

2 非特異性結(jié)合

一些熒光標(biāo)記抗體表現(xiàn)出低水平的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致陰性細(xì)胞中的熒光水平增加。這種非特異性結(jié)合通常由兩個因素引起：

單克隆抗體的同型對照：一些 IGG 型同型對照對某些細(xì)胞類型的 FC 受體結(jié)合更敏感

使用熒光素：有時 CY3、CY5、CY5.5 和德克薩斯紅直接標(biāo)記的抗體以及一些串聯(lián)偶聯(lián)抗體可增強(qiáng)與某些細(xì)胞亞群的結(jié)合。對于CY5，研究表明，這主要是由于染料與低親和力FC受體的相互作用較弱； PE-CY5標(biāo)記的抗體也有類似的效果。另外，在某些情況下（例如用抗HLA-DG PE/抗單核細(xì)胞PerCP-CY5.5分析單核細(xì)胞），該功能也可用于有意增加標(biāo)記抗體中CY染料的標(biāo)記量，這確保了無論每個單核細(xì)胞的 CD14 表達(dá)水平有何差異，都可以檢測到單核細(xì)胞。

總之，在通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行多色分析時，應(yīng)仔細(xì)選擇熒光抗體標(biāo)記的熒光染料。主要影響因素有：根據(jù)不同型號選擇合適的熒光抗體（激光功率和波長）；染色細(xì)胞抗原表達(dá)的相對密度（表達(dá)密度低的抗原應(yīng)選擇較亮的熒光染料）； FC 對陰性細(xì)胞受體狀態(tài)。另外，在進(jìn)行多色分析時，需要盡可能選擇熒光波之間光譜重疊較少的熒光染料進(jìn)行組合，同時需要進(jìn)行正確的調(diào)整和補(bǔ)償。

3. 熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)整

當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種或多種熒光素（如PE和FITC）并被激光激發(fā)發(fā)射兩種以上不同波長的熒光時，理論上可以選擇濾光片使得每種熒光只能被相應(yīng)的檢測器檢測到，而將不會檢測到其他熒光。然而，由于目前使用的各種熒光染料具有較寬的發(fā)射光譜特性，雖然各自的發(fā)射峰不同，但發(fā)射光譜范圍有一定程度的重疊，因此少量不需要檢測的另一種熒光信號也會被檢測到。被檢測到。是通過這個光電倍增管來檢測的，所以每個光電倍增管實際上檢測的是兩種熒光的總和，只不過每種熒光都以某一種熒光為主。熒光素的發(fā)射光譜有一定的范圍，其發(fā)射信號的極小部分必然會進(jìn)入另一次檢測。 FITC 檢測器將檢測少量的 PE 光譜，而 PE 光譜檢測器將檢測更多的 FITC 光譜。

由于光譜重疊占檢測信號的一定比例，因此熒光補(bǔ)償?shù)姆椒ㄊ菑慕邮盏降臒晒庑盘栔袦p去另一檢測器中接收到的信號（即光譜重疊）的一部分，從而使另一檢測器信號 該檢測器檢測到的信號與負(fù)背景信號一致，因此光電倍增管中輸出的信號實際上僅代表一定檢測的信號，而不受其他波長的熒光信號的干擾。利用標(biāo)準(zhǔn)的已知單陽性樣本，可以合理設(shè)定熒光信號的補(bǔ)償值。補(bǔ)償程度可以通過同時測量雙熒光參數(shù)的儀器條件來確定。補(bǔ)償時，首先測量染料的熒光 (FL1)。此時，除了應(yīng)接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器有信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常出現(xiàn)微弱的輸出。調(diào)整補(bǔ)償 然后調(diào)整補(bǔ)償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調(diào)節(jié)補(bǔ)償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號匹配。負(fù)面信號是一致的。如此反復(fù)調(diào)整，F(xiàn)L1和FL2探測器即可得到充分補(bǔ)償。除了應(yīng)接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器的信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常輸出微弱。調(diào)整補(bǔ)償 然后調(diào)整補(bǔ)償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調(diào)節(jié)補(bǔ)償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號匹配。負(fù)面信號是一致的。如此反復(fù)調(diào)整，F(xiàn)L1和FL2探測器即可得到充分補(bǔ)償。除了應(yīng)接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器的信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常輸出微弱。調(diào)整補(bǔ)償 然后調(diào)整補(bǔ)償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調(diào)節(jié)補(bǔ)償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號匹配。負(fù)面信號是一致的。如此反復(fù)調(diào)整，F(xiàn)L1和FL2探測器即可得到充分補(bǔ)償。調(diào)整補(bǔ)償 然后調(diào)整補(bǔ)償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調(diào)節(jié)補(bǔ)償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號匹配。負(fù)面信號是一致的。如此反復(fù)調(diào)整，F(xiàn)L1和FL2探測器即可得到充分補(bǔ)償。調(diào)整補(bǔ)償 然后調(diào)整補(bǔ)償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調(diào)節(jié)補(bǔ)償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強(qiáng)度與負(fù)信號匹配。負(fù)面信號是一致的。如此反復(fù)調(diào)整，F(xiàn)L1和FL2探測器即可得到充分補(bǔ)償。

進(jìn)行多色分析時，必須使用每個熒光素單陽性樣品進(jìn)行檢測，并調(diào)整與其他熒光通道的補(bǔ)償，以保證多色分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于多色分析熒光補(bǔ)償?shù)膹?fù)雜性，許多分析軟件都允許離線補(bǔ)償，這為操作者提供了極大的便利。

值得注意的是，補(bǔ)償與特定實驗的特定熒光素組合、特定儀器條件設(shè)置有關(guān)。補(bǔ)償設(shè)置后，如果光電倍增管的電壓、激光器的波長、濾光系統(tǒng)等發(fā)生變化，熒光補(bǔ)償值就會發(fā)生變化，需要重新調(diào)整補(bǔ)償。