介紹

體外 轉(zhuǎn)染過程 涉及將遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞，通常通過非病毒方法用于哺乳動物細(xì)胞 [1]。各種治療性貨物分子可用于細(xì)胞內(nèi)遞送至癌細(xì)胞系和原代細(xì)胞，包括質(zhì)粒 DNA (pDNA)、蛋白質(zhì)、小分子、信使 RNA (mRNA) 和RNA，例如短干擾 RNA ( siRNA ) 和微小 RNA (miRNA) ) [2]。Altogen Biosystems 通過將組合化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方面的專業(yè)知識應(yīng)用于轉(zhuǎn)染技術(shù)的開發(fā)，為特定細(xì)胞系開發(fā)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染技術(shù)。

自 1950 年代以來，轉(zhuǎn)染一直在使用，并且仍然是細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要元素，其技術(shù)范圍從物理技術(shù)（如電穿孔）到使用磷酸鈣的化學(xué)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，甚至脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù) [3]。在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，遺傳物質(zhì)包含在脂質(zhì)體中通過將材料與陽離子脂質(zhì)混合，脂質(zhì)體將其“貨物"沉積到靶細(xì)胞中。可以針對目標(biāo)細(xì)胞系優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑，也可以定制轉(zhuǎn)染方案。最近出現(xiàn)了幾種先進(jìn)的方法，例如基于脂質(zhì)和聚合物的載體分子。這些化合物能夠產(chǎn)生脂質(zhì)體，脂質(zhì)體可以與細(xì)胞膜融合，以便將結(jié)合的 RNA 或 DNA 遞送至細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染：作用機(jī)制

體外 轉(zhuǎn)染是將外源分子和遺傳物質(zhì)、DNA或 RNA 瞬時或穩(wěn)定地引入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中。盡管轉(zhuǎn)染技術(shù)存在方法學(xué)多樣性，但化學(xué)轉(zhuǎn)染是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室研究中使用的技術(shù)。使用的轉(zhuǎn)染試劑含有陽離子脂質(zhì)，有助于將 DNA 和 siRNA 遞送到細(xì)胞中 [4]；雖然陽離子聚合物是最早使用的化學(xué)品之一，但陽離子脂質(zhì)現(xiàn)在是當(dāng)今使用廣泛的化學(xué)品。化學(xué)轉(zhuǎn)染背后的科學(xué)原理保持不變，它基于載貨分子與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層之間的靜電相互作用. 基本上，帶負(fù)電荷的遺傳物質(zhì)與帶正電荷的試劑結(jié)合，使遺傳物質(zhì)能夠穿過細(xì)胞膜，從而通過內(nèi)吞作用發(fā)生細(xì)胞攝取。在細(xì)胞內(nèi)部，轉(zhuǎn)染復(fù)合物可用于多種目的。如果 DNA 被轉(zhuǎn)染，則穩(wěn)定表達(dá)需要它進(jìn)入細(xì)胞核，從而導(dǎo)致基因表達(dá) [5]。可能影響特定化學(xué)選擇的因素取決于轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)，但 pH 值、細(xì)胞類型以及遺傳物質(zhì)與試劑的比例等因素對于正確的實(shí)驗(yàn)設(shè)置至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)染方法

將 DNA 和 RNA 引入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞可能需要不同的轉(zhuǎn)染方法，具體取決于特定的細(xì)胞系和最終目標(biāo)。此類方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑（脂質(zhì)和聚合物）、基于樹枝狀聚合物的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、病毒介導(dǎo)的基因遞送、RNA 干擾 (RNAi)、siRNA 轉(zhuǎn)染、高通量 siRNA 篩選和基因沉默 (RNAi) [6, 7, 8]。

轉(zhuǎn)染試劑

對于化學(xué)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來說，保持細(xì)胞活力極為重要；如果細(xì)胞因用于轉(zhuǎn)染的有毒化學(xué)品而死亡，則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。轉(zhuǎn)染試劑之所以眾多，正是因?yàn)槟承┘?xì)胞類型需要更溫和的條件或特殊添加劑來防止細(xì)胞毒性。就此而言，Altogen Biosystems 提供了專為特定細(xì)胞系設(shè)計的種類齊全的試劑，專門設(shè)計用于提高轉(zhuǎn)染效率，同時防止細(xì)胞死亡。

轉(zhuǎn)染試劑本身由專門針對特定細(xì)胞類型優(yōu)化的緩沖液配方組成。在某些情況下，轉(zhuǎn)染試劑可包括旨在幫助所需化合物進(jìn)入細(xì)胞的分子。例如，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將包括脂質(zhì)體鏈，其封裝給定的核酸序列并允許其被細(xì)胞內(nèi)吞。另一個例子是用納米粒子制成的轉(zhuǎn)染試劑，它可以結(jié)合所需的序列并幫助它們穿過細(xì)胞膜。

與所需貨物結(jié)合的轉(zhuǎn)染試劑和影響細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)染試劑之間應(yīng)該有一個重要的區(qū)別。例如，電穿孔緩沖液是一種轉(zhuǎn)染試劑，它允許細(xì)胞膜變得可滲透，從而允許外來顆粒進(jìn)入細(xì)胞。然而，電穿孔緩沖液不封裝核酸序列，因此電穿孔實(shí)驗(yàn)必須依賴轉(zhuǎn)染化合物的獨(dú)立穩(wěn)定性。

體外 轉(zhuǎn)染研究

Altogen Biosystems 提供針對不同細(xì)胞系優(yōu)化的不同體外轉(zhuǎn)染試劑，例如 A549 細(xì)胞（肺癌）、DU145 細(xì)胞（前列腺癌）、MCF-7 細(xì)胞（乳腺癌）和 HepG2 細(xì)胞（肝細(xì)胞癌）。以下是使用  細(xì)胞系特異性體外轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行的幾項研究的數(shù)據(jù)匯編。

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（肺癌細(xì)胞，CCL-185）

圖 1.按照推薦方案轉(zhuǎn)染靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA。在轉(zhuǎn)染后 48 小時，通過 qRT-PCR 分析 A549 細(xì)胞的基因表達(dá)水平。18S rRNA 水平用于標(biāo)準(zhǔn)化 Lamin A/C 數(shù)據(jù)。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 雙組分制劑提高了脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率，

• 為 RNA 和 DNA 的轉(zhuǎn)染提供了優(yōu)化的易于使用的轉(zhuǎn)染方案

• 血清存在下的高轉(zhuǎn)染效率

• 適用于標(biāo)準(zhǔn)反向轉(zhuǎn)染和高通量應(yīng)用。

• 試劑表現(xiàn)出至少 80% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率通過實(shí)時RT-PCR確定。

圖 2. Lamin A/C 在 A549 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案，將表達(dá) Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 A549 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時，通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平（通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì)）。未處理的細(xì)胞用作陰性對照。

DU145 細(xì)胞（前列腺癌細(xì)胞，HTB-81）轉(zhuǎn)染試劑

圖 3.按照推薦方案將靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA 轉(zhuǎn)染到 DU-145 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 48 小時，通過 qRT-PCR 分析細(xì)胞的 Lamin A/C 基因表達(dá)水平。18S rRNA 水平用于標(biāo)準(zhǔn)化 Lamin A/C 數(shù)據(jù)。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=4)。

• 專有陽離子脂質(zhì)配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率

• 產(chǎn)生一致的結(jié)果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 一種經(jīng)過驗(yàn)證的用于建立穩(wěn)定細(xì)胞系的試劑

• 優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案適用于標(biāo)準(zhǔn)和反向轉(zhuǎn)染方法。

• 有效且穩(wěn)健的細(xì)胞內(nèi)遞送

• 試劑盒包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑試劑

• 在血清存在下工作

• 試劑表現(xiàn)出至少 75% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。

圖 4. Lamin A/C 在 DU145 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案，將表達(dá) Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 DU145 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時，通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平（通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì)）。未處理的細(xì)胞用作陰性對照。

MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（乳腺癌細(xì)胞，HTB-22）

圖 5 。在用靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 轉(zhuǎn)染的 MCF-7 細(xì)胞中，使用實(shí)時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進(jìn)行量化。轉(zhuǎn)染后 48 小時，收獲細(xì)胞并通過實(shí)時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達(dá)水平。數(shù)據(jù)針對 18S rRNA 信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對照樣品是模擬轉(zhuǎn)染的或未處理的。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 專有陽離子脂質(zhì)配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率

• 產(chǎn)生一致的結(jié)果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一種經(jīng)過驗(yàn)證的用于建立穩(wěn)定細(xì)胞系的試劑

• 試劑表現(xiàn)出至少 85% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。

圖 6. MCF-7 細(xì)胞中 GAPDH 的蛋白表達(dá)。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案，將表達(dá) GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 MCF-7 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時，通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平（通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì)）。未處理的細(xì)胞用作陰性對照。

HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（肝癌細(xì)胞，HB-8065）

圖 7.在轉(zhuǎn)染了靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 的 HepG2 細(xì)胞中，使用實(shí)時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進(jìn)行了定量。轉(zhuǎn)染后 48 小時，收獲細(xì)胞并通過實(shí)時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達(dá)水平。數(shù)據(jù)針對 18S rRNA 信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對照樣品是模擬轉(zhuǎn)染的或未處理的。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率

• 有效且穩(wěn)健的細(xì)胞內(nèi)遞送

• 產(chǎn)生一致的結(jié)果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一種經(jīng)過驗(yàn)證的用于建立穩(wěn)定細(xì)胞系的試劑

• 試劑表現(xiàn)出至少 90% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。

圖 8. HepG2 細(xì)胞中 GAPDH 的蛋白表達(dá)。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案，將表達(dá) GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 HepG2 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時，通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平（通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì)）。未處理的細(xì)胞用作陰性對照。

結(jié)論：

轉(zhuǎn)染是一項經(jīng)過充分測試且至關(guān)重要的生物技術(shù)，它使研究人員能夠直接在細(xì)胞中研究基因產(chǎn)物和基因功能。不同的轉(zhuǎn)染方法允許以非常特定的方式傳遞遺傳物質(zhì)，從而使其成為臨床前生物學(xué)研究中極其通用的工具。選擇最佳方法涉及實(shí)施最佳轉(zhuǎn)染試劑，以及選擇最佳實(shí)驗(yàn)設(shè)計。

Altogen Biosystems 提供預(yù)優(yōu)化和細(xì)胞系特異性體外轉(zhuǎn)染試劑和試劑盒。在他們的網(wǎng)站上了解更多關(guān)于這些轉(zhuǎn)染試劑和試劑盒的信息，并加快您今天的臨床前生物學(xué)研究。